Microscopíes, més enllà dels cons i bastons

Un recorregut pels diferents tipus de microscopis fins als actuals que ens permeten veure fins i tot els àtoms dels materials.

Ens situem en el segle XVII quan les eines per veure més enllà del que la nostra vista encara estaven per perfeccionar, ja que el primer microscopi del segle XVI de Zacharias Janssen es basava en dos lents convergents que permetien només 9 augments, l'objectiu inicial no era pas fer un microscopi sinó fer unes lents per la gent que tenia moltes diòptries.

A principis del segle XVII Johannes Kepler suggereix una forma de fabricar microscopis compostos que posteriorment Robert Hooke usarà per estudiar el suro i veure les petites cel·les anomenades cèl·lules. Va ser als finals d'aquest segle quan Anton van Leeuwenhoek va perfeccionar aquest microscopi. Aquest no és per res similar al que entenem ara per microscopi òptic, aquest semblava més a una lupa, ja que en el seu recorregut com a comerciant de teles l'havia d'usar, per tant la va perfeccionar: va usar lents biconvexes sobre platines de llautó que s'aguantava prop de l'ull com si fossin ulleres i tenia un augment de 200x.

Microscopi usat per Robert Hooke. Imatge extreta de: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/30/Hooke_Microscope.jpg/220px-Hooke_Microscope.jpg

Microscopi disenyat per Leeuwenhoek. Imatge extreta de: http://1.bp.blogspot.com/_10QP1AIdVug/S8Dt-emR46I/AAAAAAAAAC4/JbYFrRAKEPs/s1600/microsc%C3%B3pio.gif

Durant el segle següent el microscopi va tenir avenços mecànics que augmentaven la seva estabilitat i facilitat d'ús . Les millores es van produir al final del segle XIX arran de les publicacions de Ernst Abbe sobre la teoria del microscopi, la millora va consistir en la substitució de l'aigua per oli la qual cosa va permetre obtenir augments de 2000x.

El gran canvi de la microscòpia va ser al segle XX amb el microscopi electrònic que es basava en la interacció dels electrons (TEM 1931, SEM 1942) amb la mostra i els posteriors basats en la proximitat (STM 1981, SNOM 1984, AFM 1988, SECM 1989).

Tipus de microscopis:

Segons el nombre d'oculars: Monocular, binocular (la imatge és dividida mitjançant una prima òptica), trinocular (consisteix en dos oculars per la persona i un tercer per connectar una càmera) i digital (que consisteix en una càmera en comptes d'ocular).

Segons el tipus d'interacció amb la mostra: òptic (interacció amb llum visible), electrònic (interacció amb electrons) i de proximitat (basat en la interacció directa amb la mostra, topografia).

Segons l'il·luminació: electrònic (electrons), òptic (llum visible), llum ultraviolada (major resolució i contrast que l'òpitc), llum polaritzada (una longitud d'una amb una direcció concreta d'oscil·lació, útil per observar estructures cristal·lines de minerals i roques), florescència.

Segons el mètode de transmissió de la llum: llum transmesa (la llum que travessa la mostra, es necessiten mostres molt fines, el focus de la llum esta situada sota la mostra), llum reflectida (el focus de la llum se situa sobre la mostra, útil per a mostres opaques).

Característiques

Microscopi òptic

Basat en lents òptiques i la llum visible, és el més bàsics dels microscopis, però el que va marcar un abans i després per a la biologia i medicina. La imatge que s'obté esta invertida. Els augments** de la mostra són definits per la multiplicació del número d'augments de l'objectiu pel de l'ocular ( el més usat sol ser de 10x). Comunment és sol associar als treballs de Anton van Leeuwenhoek.

Límit màxim de resolució*: 0,2 micròmetres

Parts: 

- Condensador: Lent òptica convergent que concentra la llum sobre la mostra. 

- Diafragma: disc obturador que regula la quantitat de llum que arriba a la mostra. 

- Platina: superfície on es col·loca la preparació, amb pinces que la subjecten i un braç que permet el seu desplaçament en els dos eixos de la superfície. 

- Caragols Macro i micromètrics: per moure la platina verticalment, el micromètric és per a grans distàncies i el micromètric és per tenir més precisió. 

- Objectius: lents òptiques convergents connectades al revòlver, creen una imatge augmentada es invertida, hi ha diversos augments, el de 100x és d'immersió i es necessita posar un líquid entre la mostra i l'objectiu. 

- Revòlver: mecanisme rotatori que sosté els objectius. 

- Ocular: Lent òptica situada a la part superior del tub.

Funcionament:

La llum és emesa per la bombeta i aquesta és dispersen en direcció al condensador. El condensador recull la llum i la concentra sobre la mostra, aquesta llum travessa la mostra i es dispersa (ve determinat pel gruix i densitat de la mostra). La llum dispersada característica de cada mostra és recollida per l'objectiu i aquesta llum viatja pel tub i es torna a concentrar en la lent ocular. La lent ocular projecta una imatge magnificada i invertida de la mostra. El principi del funcionament del microscopi òptic es basa en la propietat d'alguns materials de canviar la direcció dels rajos de llum, permetent fabricar lents convergents o divergents.

imatge extreta de: https://www.enciclopedia.cat/sites/default/files/media/FOTO/123573.jpg

Imatges: 

imatge extreta de: https://www.monlau.com/eso-batxillerat/wp-content/uploads/sites/2/2020/01/prueba2.jpg

Microscopi electrònic

Aquest tipus de microscopi usa electrons en comptes de fotons per formar imatges, donat que el poder de resolució ve determinat per la longitud d'ona i la longitud d'ona dels electrons és molt inferior a la dels fotons, el poder de resolució serà major en aquests microscopis. Els primers dissenys van ser dissenyats per Ernst Ruska i Max Knoll entre el 1925 i 1932. L'obertura està molt limitades amb la qual cosa la resolució es veu limitada. Es basa en el principi físic de la dualitat ona-partícula dels electrons i la capacitat de ser accelerats en un camp elèctric i desviats per un camp magnètic. Existeixen dos tipus: TEM en què la imatge es forma a partir dels electrons que travessen la mostra i SEM en què la imatge es forma a partir dels electrons que emet la mostra en ser bombardejada i els electrons retrodispersats. Això forma imatges molt diferents entre cada tipus, el TEM permet veure estructures en un mateix pla d'enfocament mentre que el SEM s'obté informació de la superfície de la mostra.

Les imatges obtingudes es recullen sobre una placa 

Microscopi electrònic TEM

Processat de les mostres: Fixar la mostra en un bloc de resina i fer talls ultrafins d'aquest (no majors de 2000 àngstroms). Posteriorment es tenyeixen amb sals de metalls pesants, com citrat de plom o l'acetat d'urani. També es poden processar mitjançant criofractura (congelar la mostra i colpejar-les amb un ganivet separant dues capes lipídiques de diferents membranes cel·lulars). L'anàlisi de les imatges es realitza sobre una rèplica de la superfície estudiada, després d'ombrejar-la i donar li consistència amb recobriment de carbó.

Límit de resolució: 2nm

Parts: 

- Canyó d'electrons: emet els electrons. 

- Lents magnètiques: creen camps que dirigeixen i enfoquen el feix d'electrons, ja que les lents convencionals no funcionen amb els electrons. 

- Sistema de buit: donat que els electrons es poden desviar per les molècules d'aire s'ha de fer un buit perquè no afecti la imatge final. 

- Pantalla fluorescent: per recollir els electrons i visualitzar la imatge. 

- Sistema d'enregistrament: mostra la imatge en un ordinador.

imatge extreta de: http://www.inecol.mx/inecol/images/ciencia_hoy/microscopio_electronico/micro4.jpg

Funcionament: Es bombardegen electrons a través del canyó d'electrons que conté un filament de tungstens connectat a una font d'alt voltatge, aquests electrons són manipulats per les lents*** de la part superior que permeten la focalització a la mida desitjada i la localització sobre la mostra. Posteriorment aquest electrons passen per la mostra i formen la primera imatge, els electrons que han traspassat la mostra passen per unes lents intermediades i posteriorment per la lent protectora que anirà a parar a la pantalla florescent i ens donarà la imatge de la mostra.

imatge extreta de: https://www.monografias.com/trabajos106/microscopia-y-tecnicas-estudio-nivel-celular/img23.png

Imatges:

Microscopi electrònic SEM

Processat de les mostres: Col·locar el material fixat en una metal·litzadora que el recobreix d'un metall conductor, el més comú és l'or.

Límit de resolució: 4-20 nm

Funcionament: Es bombardegen electrons a través del canyó i s'enfoca amb lents condensadores i objectives, intentant que incideixi el feix més petit possible per tenir major resolució. Amb les bobines deflectores es fa passar aquest feix per tota la mostra. Quan el feix interactua amb la mostra es produeixen moltes interaccions entre els electrons i els àtoms de la mostra, el més comú són els electrons secundaris que són amb la qual es farà la imatge. Aquests electrons són recollits per un detector.

imatge extreta de: https://docplayer.es/docs-images/58/41669352/images/40-0.png

Imatges:

imatge extreta de: https://images-wixmp-ed30a86b8c4ca887773594c2.wixmp.com/f/7f18e6e4-ebcb-435b-a066-d0f9cda6ec34/d9pl3sx-cf1e1ca5-b200-4255-b682-1e3eaca0f2b1.jpg/v1/fill/w_1024,h_708,q_75,strp/tardigrade_sem_image_by_shannonteague_d9pl3sx-fullview.jpg?token=eyJ0eXAiOiJKV1QiLCJhbGciOiJIUzI1NiJ9.eyJzdWIiOiJ1cm46YXBwOjdlMGQxODg5ODIyNjQzNzNhNWYwZDQxNWVhMGQyNmUwIiwiaXNzIjoidXJuOmFwcDo3ZTBkMTg4OTgyMjY0MzczYTVmMGQ0MTVlYTBkMjZlMCIsIm9iaiI6W1t7ImhlaWdodCI6Ijw9NzA4IiwicGF0aCI6IlwvZlwvN2YxOGU2ZTQtZWJjYi00MzViLWEwNjYtZDBmOWNkYTZlYzM0XC9kOXBsM3N4LWNmMWUxY2E1LWIyMDAtNDI1NS1iNjgyLTFlM2VhY2EwZjJiMS5qcGciLCJ3aWR0aCI6Ijw9MTAyNCJ9XV0sImF1ZCI6WyJ1cm46c2VydmljZTppbWFnZS5vcGVyYXRpb25zIl19.oL2aGwwXGMUNeNdgrFMM4PB6Zkt9O8__R7CfEwPNkKs

Microscopi de proximitat STM

Va ser desenvolupat el 1981 per IBM fet que va permetre als creadors guanyar el premi Nobel en física el 1986. Aquest microscopi de tan bona resolució no necessita estar en el buit per funcionar, pot funcionar en una gran varietat de medi. El principi físic que permet el funcionament d'aquest microscopi és l'efecte túnel, aquest és la capacitat que tenen les partícules de travessar una barrera de potencial major que l'energia cinètica de la pròpia partícula, és a dir és una violació de la física clasica, ja que un electró en trobar-se amb una barrera de potencial rebotaria però aquest no és el cas, sinó que unes quantes partícules són capaces de travessar-la donat el caràcter ondulatori d'aquesta. El corrent d'efecte túnel**** que varia en una funció exponencial amb la distància, cosa que permet obtenir imatges de tan alta resolució.

Límit de resolució: xy 0,1nm, z 0,01nm

Parts: Tub piezoelèctric que es deforma amb un camp elèctric en les 3 dimensions, l'expansió o compressió de l'eix z serveix per allunyar o apropar la punta de la mostra i el moviment en x i y permet el moviment lateral, fent l'escombrat, aquests eixos estan controlats per un software, se li aplica una diferència de potencial de l'ordre de 10^-2 V. Acaba amb una punta conductora de només uns quants nanòmetres que permet prendre la imatge àtom a àtom (densitat electrònica dels estats de la superfície). Aquesta punta esta posada a una distància de 5 Angstroms de la mostra i això permet fer uns de l'efecte túnel, sol estar feta de W, Pd o Pt-Ir. Per poder fer ús d'aquesta resolució necessitem treballar sobre conductors com: Pt, Au,Cu o Ag, pel mateix efecte túnel no es pot treballar amb mostres aïllants.

Imatge extreta de:https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/57/Rastertunnelmikroskop-schema_es.svg/400px-Rastertunnelmikroskop-schema_es.svg.png

Funcionament: Es fa mantenir el corrent d'efecte túnel constant i passant la punta per tot el material, quan la distància augmenti o disminueixi degut a alguna rugositat, el software fa pujar o baixar la punta per tal de mantenir el corrent constant i permetent donar-nos informació de la topologia d'aquell material, l'anomenat feedback. Els mapes que s'extreuen són de les densitats d'electrons al voltant de nivell de fermi que no sempre coincideix amb la ubicació d'un àtom, a vegades pot coincidir amb els enllaços en compostos orgànics i si no té estats de Fermi a prop és com si fos invisible.

imatge extreta de:https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiXhwejo9Rav8M8CNAEga7kLJeEYx7av8hQim-BJ-g2EAOQO3p5_wRtr0NPlXBwhrYO9VCPVXL86gGS-LcEemt7M00tJcBvbLOK75fwReccdzXrG9mHQaQ7RXvaEHZQ5MhLcZAvbH9hSBI/s1600/microscopio+d+etunel.jpg

Imatges:

Corral quantic, imatge extreta de:https://enciende.cosce.org/imagenes/atomos_paloma1.jpg

Microscopi de proximitat AFM

El principi d'aquest microscopi es basa en la flexió del cantilever per culpa de les forces que exerceixen els àtoms, la més comuna és la força de Van der Waals. Té diferents formes de treballar, l'AFM de contacte on la punta manté contacte físic amb la mostra per tant detecta majoritàriament la força de repulsió, AFM de no contacte on s'excita el cantilever prop de la seva freqüència de ressonància de forma que vibri prop de la superfície de la mostra, mesura la força atractiva i AFM de contacte intermitent on la punta està en contacte intermitent amb la mostra, mesura la força d'atracció i repulsió.

Límit de resolució: xy 2-10nm, z 0,1nm

Parts: Escàner que consta d'un sistema piezoelèctric amb z per apropar o allunyar de la mostra i xy per l'escombratge. Punta en forma de braç de palanca (cantilever). Laser i fotodíode que són els que detecten aquests moviments de la punta.

Imatge extreta de:https://minio.scielo.br/documentstore/1678-5169/L39XFLptxB596pNrpRc4xRD/f5c550fbc840a2ff048e4bb9ddaf23ad09573373.gif

Funcionament: Depenent de quina forma de treball es vulgui usar el funcionament serà diferent. Però majoritàriament en els tres tipus el que es fa és tenir la punta o en contacte o en ressonància o en contacte intermitent i fer que el sistema mantingui constant aquesta situació. Per mesurar aquestes variacions es fa ús del làser que està posat en cert angle sobre la punta per tal que és reflecteixi la llum sobre el fotodíode que té unes coordenades que és el que mesura el software, depenent d'on és reflecteixi la llum voldrà dir que hi ha una pertorbació en la mostra i per tant ens donarà la topologia d'aquesta.

imatge extreta de:https://lqes.iqm.unicamp.br/images/lqes_empauta_novidades_1793_MFA.jpg

Imatges:

imatge extreta de: https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRxIt_ivRr2E_I0UJijOWFolU_QWhrT7sdZAQ&usqp=CAU

Comparativa

	Límit resolució	Superficies	Medi	informació	Principi fisic	Avantatges	Inconvenients
MO	0,2 μm	totes	ambient	Superficie en blanc i negro i color, in vivo	Absorció llum	Cel·lules vives i cenceres Barat Preparacions senzilles	Poc detallats
TEM	2nm	procesades	buit	Ultraestructura i components cèl·lula 2D Blanc i negre	Absorció electrons	Millor resolció que SEM Informació cristalografica i atomica Examina més caracteristiques d’una mostra que SEM	No celules vies i no es veu tot el conjunt Car Preparacions complexes
SEM	4-20nm	procesades	buit	Superficie 3D Blanc i negre	Dispeció d’electrons	Temps de creació d’imatge menor que TEM Examina grans superficies	No celules vives i no es veu tot el conjunt Car però menys que TEM
STM	xy:0,1nm z:0,01nm	conductores	Ambient	Densitat electronica	Efecte tunel	Moltisima resolució	No materials aillants
AFM	xy: 2-10nm z:0,1nm	Totes	ambient	Forces atomiques	Forces atomiques	Parametres de control, V i distancia per separat	Es produeixen vibracions no desitjades

Comparació imatges SEM i TEM, imatge extreta de: http://www.cecoltec.com/blog/wp-content/uploads/2020/04/Microorganismos-972x1024.jpg

Comparació metode d'observació entre MO, TEM i SEM, imatge extreta de: http://vision.centroculturadigital.mx/media/done/1594935158158-9-port.jpg

Imatges dels mateixos composts en AFM i STM, imatge extreta de:https://www.researchgate.net/profile/Mehmet-Baykara/publication/281261354/figure/fig8/AS:655254852997122@1533236339665/STM-A-D-and-NC-AFM-E-H-images-of-the-reactant-molecule-1.png

*poder de resolució: es la distancia minima en que es poden discriminar dos punts, ve determinat per la longitud d’ona de la font d’iluminació (llum visible: 400nm-700nm, agafant el valor mitjà: 550nm). Quan major es el poder de resolució indica que la distancia que ens permet distinguir dos punts separats és més petita.

**Els augments dels objectius venen indicats amb una X

*** Interacció electrons amb un camp magnetic que es mouen d’acrd amb:F= (q.v) x B on v es el vector velocitat de l’electró i B el vector camp magnetic. Permet la formació d’una lent magnetica de distancia focal variable.

**** I = AV exp (-√θS). Sent I la corrent d’efecte tunel, S la distancia de separació entre la punta i la mostra en angstoms, V el voltatje aplicat, A es una constant que depen de la densitat d’estats electronics en el sistema punta-mostra, θ és la funcio de treball en eV en cada punt de la superficie.